許多蛋白質(zhì)分子在其表面含有較多的賴氨酸殘基。這些賴氨酸殘基的游離ε - 氨基可與 FITC （其激發(fā)波長為 492nm, 發(fā)射光波長為 525nm ）共價結(jié)合。與 FITC 結(jié)合的抗體可用為特異性的探針，以測定細(xì)胞相應(yīng)抗原的存在。 FITC 具有很高的量子產(chǎn)量（發(fā)射光與吸收光的比值 ,0 .85 ），而且形成的偶聯(lián)物的穩(wěn)定性很好。 FITC 是應(yīng)用*廣的染料，流式細(xì)胞儀就按 FITC 的特性，設(shè)計了激光波長為 488 nm, 很接近于 FITC 的*大激發(fā)波長 492nm ）。 
     偶聯(lián)反應(yīng)是在 pH 9.8 條件下，賴氨酸殘基的游離ε - 氨基與 FITC 發(fā)生的親核反應(yīng)，由此形成硫脲連接。 
操作步驟 
１． 用碳酸氫鈉緩沖液 pH9.8 稀釋抗體為 1-5mg/ml ，或抗體對該緩沖液充分透析，以足以使賴氨酸不解離（去其正電荷），但注意保持大部分蛋白質(zhì)仍未變性； 
２． 將透析袋放入 100ml 含 0 .1 mg/ml FITC 的 pH9.8 碳酸氫鈉緩沖液（新配制）的燒杯中，用鋁鉑包燒杯以避光， 4 ℃攪拌過夜； 
３． 上述抗體液對 PBS 在 4 ℃透析以終止反應(yīng)。其間至少更換 PBS 液三次，直致 480nm 的吸收為零； 
４． 加入 0.5g/L 的疊氮鈉。此后，結(jié)合物在 4 ℃避光保存，或分裝后在－ 2 ０℃凍存。
實驗要點及說明 
１． 偶聯(lián)反應(yīng)要求在盡可能接近 pH9.8 的溶液中進(jìn)行，而且注意在反應(yīng)過程中要保持此 pH 水平； 
２． 要確定在偶聯(lián)反應(yīng)緩沖液中不含游離氨基（ Tris, 氨及疊氮鈉均可與 FITC 反應(yīng)，因此會降低蛋白質(zhì)與 FITC 的偶聯(lián)率）； 
３． FITC 與蛋白質(zhì)的比值（ F/P ） , 可通過測定 495nm 與 280nm 吸光度來鑒定。此比值的范圍應(yīng)為０ .3 －１ .0 ； 
４． FITC **的缺限是易被光淬滅，因此復(fù)合物必須始終避光保存； 
５． 如果 FITC －復(fù)合物對 PBS 透析不充分，可能造成高本底，對**染色產(chǎn)生干擾； 
６． 如果被標(biāo)記的蛋白質(zhì)是**抗體或通用的**抗體，則從商品購置可能更方便可取。